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Cell亮点︱核内“液相分离”对染色质结构的感知

来源:未知 作者:澳门金沙6088.com 时间:2019-02-16 14:06

  近日围绕“相分离”的研究论文不断涌现,但是来自国内发表的文章还非常少,但是这并不意味着国内研究得少。2018年12月14日-16日,一个小范围、高层次的多学科参与的相分离专题会议将在中国科学技术大学召开。本次会议安排了20多个报告,应该说这些报告内容基本上没有发表。可以预见,在未来1-2年中国内会有大量涉及“相分离”的工作发表。BioArt昨日推出《专家解读Cell丨基因表达调控研究进入新阶段“Phase”》一文后,关于相分离与转录调控的话题引起了小范围热烈讨论。熟悉相分离的读者应该知道,Brangwynne和Hyman 2009年发表的关于线虫P颗粒的研究,该工作可以称得上是相分离领域的奠基性工作,Brangwynne 2011年在普林斯顿大学独立成立了自己的实验室,最近他们实验室连续在CNS系列发表了不少相分离的相关工作。为了响应“相分离”的专题会议,BioArt今日继续推出相关研究解读。今日推出的文章是Cliff Brangwynne课题组近期发表在Cell上的工作,以飨读者!

  生物大分子的相变/相分离是近年来飞速发展的热门领域。自2009年德国马普所Tony Hyman教授与其博后Cliff Brangwynne发现线虫中的P.granules 实际上是蛋白质聚集形成的“液-液相分离”现象以后,科学家们逐渐发现细胞内的许多无膜细胞器——核仁、Cajal bodies、stress granules、miRISC,及突触的细胞骨架——都是特定的蛋白质/RNA的相变【1】。相变现象如此之普及,而促使液滴成核、生长的物理作用力为何,相变是否影响染色质结构,这些基本的问题尚未得到解决。

  Cliff Brangwynne,2007年哈佛大学博士学位,2011年加入普林斯顿大学,现为化学与生物工程副教授,2018年入选为HHMI研究员。图片引自:

  2011年,Cliff Brangwynne在普林斯顿大学成立了自己的实验室,仍将研究重点集中于相分离现象及其机制上,并开发了一套能够在活细胞内发现、控制、调节“相分离”的方法。2017年,Brangwynne组在Cell上发表论文构建了一个光控的系统(OptoDroplets,下图)用于研究细胞内的相变过程【2】。

  在上述系统基础之上,Brangwynne组又设计了CasDrop系统(下图)。该体系由三个组分构成:SunTag标记的dCas9蛋白用于将体系锚定到特定的基因位点【3】;scFv标记的sfGFP和iLID融合蛋白用于构建光敏的多聚体;以及sspB标记的目的蛋白IDR(intrinsically disordered regions,IDRs)区域。在表达sgRNA的情况下,scFv-GFP-iLID蛋白被SunTag募集到SunTag-dCas9结合的基因位点处,由于一个SunTag可以结合24个scFv,故此处形成dCas9-ST-GFP-iLID蛋白的多聚体foci;在不表达sgRNA的情况下,dCas9-ST-GFP-iLID蛋白在胞内则成弥散状,在蓝光刺激下,sspB结合到iLID上,目的蛋白IDR相分离使得蛋白多聚,形成foci。该体系可以定量、定位地研究多种蛋白的相分离现象。

  作者主要研究了FUS、BRD4、TAF15三个蛋白,三者均能在CasDrop体系的诱导下形成核内“液-液相分离”现象,且BRD4△N形成液滴的能力最强。在不表达sgRNA的情况下,作者发现BRD4△N更倾向于在染色质结构疏松处形成液滴。荧光共定位实验发现,液滴形成处的H2B-miRFP670的荧光强度有显著下降,提示相分离易发生在染色质密度较低的区域。随着液滴的增长,液滴所在区域的染色质会被进一步“推出”该区域,表现为H2B-miRFP670在相变处的荧光强度随时间延长而逐步下降。

  内源/合成的IDR所致相变均发生在染色质密度较低的区域,且随液滴增长,相变区域的染色质密度进一步降低

  与此现象相符的是,细胞内核仁、Cajal body、PML body、亚细胞核(nuclear speckles)等无膜结构细胞器也倾向于在染色质密度较低处形成(下图)【4】。

  随后,作者对相变形成的物理机制进行了详细探讨。作者以公式的形式描述了“液-液相分离”的液滴与可变形的染色质间的相互作用,液滴成核时的自由能损耗△F可通过下式描绘:

  该公式说明较小的液滴在染色质密度高或低的区域均可以形成;而当液滴达到光学可分辨的大小时,则倾向于在机械上较软的区域(mechanically soft area)即染色质低密度区形成。

  此外,该公式还推测:在染色质密度足够的区域,机械变形能将限制液滴的大小在一个临界值以下。作者利用CasDrop体系观察了BRD4在微卫星重复区、端粒和致密异染色质区的相变,发现BRD4在染色质低密度区域能够被诱导形成液滴,而在染色质高密度区,BRD4的液滴则仅在其周围形成液滴。计算模拟也得到了类似的结果——液滴在异染色质区域将形成花瓣样结构(下图)。当CasDrop体系将BRD4的液滴锚定在异染色质区域内HP1α密度相对较低的区域时,作者发现随着液滴的增大,HP1α被逐步剔除出该区域;而部分增大的BRD4液滴则可以扰乱异染色质的结构,最终使得该区域形成染色质密度下降。这些发现表明在相变发生的过程中,其周围的染色质提供了一定的机械阻力。

  BRD4“液-液相分离”的液滴与HP1α富集的异染色质互不相溶,形成花瓣样结构

  考虑到先前研究表明,超级增强子和其他核蛋白的相变能够将特定基因区域的距离拉近【5, 6】,作者对集中于端粒的“液-液相分离”液滴进行了进一步研究:端粒区的相变如花瓣样集中于异染色质的周围,液滴与异染色质间相互粘附;当两个液滴相互融合时,其各自所粘附的异染色质区域则靠拢在一起。

  本文所证实的核内相变液滴排斥染色质的倾向有其物理学意义:“液-液相分离”液滴对染色质的排斥会导致染色质结构的重塑。这一过程则需要应变能——即染色质内部储存的机械能的释放——而这一过程从热力学角度来讲是不经济的。因此,染色质本身的性质会影响相变液滴的形成——即相变易发生在染色质结构较为疏松、应变能较低的区域;染色质致密区域的较小的相变液滴则最终倾向于溶解。“液-液相分离”的这一性质被总结为染色质过滤模型(“Chromatin Filter” model)(下图),即结合在特定基因位点的蛋白质的相变能够将距离较远的基因拉近,且排斥不含结合位点的背景基因区域。这保证了超级转录因子在染色质结构疏松的区域的聚积、对染色质的折叠、和促进活跃基因的表达(Science亮点丨超级增强子通过相分离调控基因表达)。

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